一、Western blot概述
        Western Blot采用的是變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)混合物，經(jīng)過SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)被到轉(zhuǎn)移到固相支撐物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持膜上蛋白質(zhì)或多肽的抗原性質(zhì)不變，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與其對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶標記的二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色以檢測特異蛋白質(zhì)表達水平。
由于Western blot檢測技術(shù)具有簡便，快捷等特點，所以目前該技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達水平的檢測。
 
二、技術(shù)服務(wù)服務(wù)內(nèi)容
  1、蛋白質(zhì)抽提與定量；
  2、Western blot
  3、圖片分析；
  4、Western blot實驗報告提交。
 
三、送樣須知，為了保證Western blot實驗?zāi)茼樌M行，樣品寄送需滿足以下要求：
       顧客提供：組織、細胞、蛋白質(zhì)溶液等；一抗（如果公司抗體庫里沒有）。
       運輸要求：干冰或液氮包裝寄送，廣州本地客戶可上門收樣。
               注：樣本應(yīng)避免各類污染和反復(fù)凍融。
 
四、實驗報告內(nèi)容
  1、Western blot蛋白質(zhì)濃度及電泳上樣量；
  2、原始膠片和電子圖片、圖片分析結(jié)果；
  3、Western blot完整的實驗報告,包括實驗步驟、使用儀器和試劑等。
 
五、實驗案例


 
六、服務(wù)周期及收費標準: 歡迎登陸  www.fitgene.com   服務(wù)熱線 400-699-1663

七、服務(wù)質(zhì)量承諾：利用內(nèi)參精確定量，并提供清晰、客觀的western結(jié)果。
 
 
附：Western blot 實驗步驟
 1、Western blot蛋白質(zhì)提取：根據(jù)實驗?zāi)康牡牟煌x擇不同的裂解液，如RIPA裂解液、NP-40裂解液、SDS裂解液，同時根據(jù)蛋白質(zhì)提取組分的不同選擇不同的方法，如提取核蛋白，細胞質(zhì)蛋白，膜蛋白等。

 2、蛋白定量，根據(jù)蛋白質(zhì)的提取條件不同，可采取不同的定量方法，如bradford法、BCA法等。

 3、電泳，依據(jù)需要檢測蛋白的分子量選取分離膠的濃度，分別配置分離膠和積成膠，凝膠凝固后進行蛋白質(zhì)上樣和電泳。

 4、轉(zhuǎn)膜，可采取半干法和濕法轉(zhuǎn)移，當采取半干法轉(zhuǎn)膜時需防止短路：從下到上的順序：濾紙/PVDF膜/凝膠/濾紙/陰極（bio-rad轉(zhuǎn)膜儀)。

 5、封閉：5%脫脂奶粉或5% BSA封閉過夜或室溫1小時,孵育時間可根據(jù)實驗需要進行改變。

 6、一抗孵育，5%脫脂奶粉稀釋一抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時4度過夜，孵育時間可參考抗體說明書，并加以優(yōu)化，一抗孵育后TBST洗膜3次，每次5分鐘。

 7、 二抗孵育，5%脫脂奶粉稀釋二抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時，TBST洗膜3次，每次5分鐘。

 8、顯影(ECL法）：將A、B兩種底物按比例稀釋混合均勻后滴在膜上，置于壓片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒進行曝光，曝光一定時間后取出膠片，浸入顯影液中顯影，直到出現(xiàn)清晰的蛋白質(zhì)條帶，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標定Marker，掃描膠片和Western blot 圖片分析。